miércoles, 16 de noviembre de 2011

3.4.1 PRODUCCION DE HAPLOIDES CULTIVO DE ANTERAS Y OVULOS.

3.4.1 PRODUCCION DE HAPLOIDES  CULTIVO DE ANTERAS Y OVULOS.
Las metodologías disponibles para obtener cantidades considerables de haploides duplicados permitirán que el fitomejorador fije sistemas genéticos de gametos individuales, que sean reducidos y fáciles de evaluar en cualquier etapa del proceso de mejoramiento; se obtendrán así líneas homocigóticas sin pasar por el proceso de endogamia normal.
Los métodos mas ampliamente usados para la creación de haploides y de haploides duplicados se valen de la hibridación interespecifica o intergenerica, y del cultivo de esporas (masculinas o femeninas).
Los granos de polen de la papa silvestre (solanum phureja), p. ej. Contienen solo un núcleo generativo causado por una gametogénesis anormal; después de la hibridación interespecifica, con S. tuberosum como hembra, la fertilización doble no logra producirse, pero la célula del huevo de S. tuberosum es inducida a formar embriones partenogenicamente, y para ello estos serán haploides. Esta vía puede seguirse también en otras especies poliploides.
Diversas rutas hacia la obtención de la haploidia en plantas superiores, y su relación con la alteración de generaciones gametofiticas y esporofiticas. Los principales métodos para la obtención de heterofitos haploides emplean técnicas in vitro, como la androgénesis y la ginegenesis; otros procesos recurren a la partenogénesis y a la eliminación de cromosomas después de la hibridación interespecifica o intergenerica.
Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa específica de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar embriones o callo. Transferidos estos a medios de regeneración, se forman plantas haploides estériles pero en algunas especies ocurre una duplicación espontanea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y de regeneración de la planta.
CONDICIONES QUE AFECTAN EL CULTIVO DE ANTERAS.
Genotipo de las plantas donantes.
El genotipo es quizás el factor más importante que afecta el cultivo de anteras. Lam variabilidad en la respuesta al cultivo de anteras se ha hallado entre especies y dentro de ellas, y se ha demostrado la heredabilidad de esta respuesta (Wenzel y Uhrig, 1981). Dicha capacidad para el cultivo de anteras es particularmente evidente en cultivares de arroz de los tipos Japónica e Indica de los cuales el primero es mas sensible que el ultimo así mismo, los genotipos invernales de B. napus dan una respuesta mas fuerte a ese cultivo que los tipos de primavera (Keller et al., 1987).
Además de la capacidad genotípica general para el cultivo de anteras, se han determinado, en la cebada y en el trigo, rasgos heredados independientemente respecto a componentes específicos de la androgénesis, como la inducción de callo y la regeneración de plantitas (Wenzel et al., 1985; Lazar et al., 1984). Se demostró que ambos rasgos eran altamente heredables, lo que sugería la posibilidad de obtener una ganancia rápida en la selección.
Albinismo.
Otro factor importante, especialmente en los cereales, es la ocurrencia de plantas albinas procedentes de polen. Estas plantas representan el 100% de algunas variedades de arroz; a menudo, pero no siempre, las variedades de arroz intensamente albinas se caracterizan también por una alta regeneración de la planta total (verdes más albinas). Sin embargo, esta correlación no vale para los híbridos.
Pretratamiento de las anteras.
El tratamiento de las anteras con temperatura baja o alta, con choque osmótico, o con otros estímulos tiende a aumentar la producción de plantitas de polen. El tratamiento de las anteras, o de las panículas, de arroz con 35 C durante 10 a 15 minutos, seguido por un periodo de 8 días a 10 C, aumenta la respuesta al cultivo de anteras; un efecto similar, no obstante, se obtiene con un tratamiento de 10 C durante 8 días solamente. El tratamiento de frio se ha relacionado con una disminución en el albinismo de los cereales, así como con la estimulación de la división mitótica ecuacional de las microesporas androgeneticas (Ouyang, 1986). 
  
3.4.2 VARIACION SOMACLONAL.
Esta plenamente comprobado que ocurren modificaciones genéticas en las células y los tejidos cultivados in vitro. Muchas de estas modificaciones se manifiestan como mutaciones heredables a las progenies de las plantas regeneradas. Este fenómeno se conoce como variación somaclonal (Larkin y Scowcroft, 1981).
A diferencia de otros procesos de variación genética, se ha encontrado variación somaclonal en la progenie del 15% de las plantas regeneradas; la tasa de ocurre4ncia de mutaciones espontaneas, p. ej., es solo de una en un millón.
La variación somaclonal es superior también al mejoramiento por mutaciones inducidas puesto que en las plantas regeneradas que derivan de células individuales, la ocurrencia de mosaicos es mínima. En la mayor parte de los casos, por tanto, los somaclones pueden estabilizarse en una generación; las mutaciones, en cambio, requieren varias generaciones y retrocruces. La regeneración de plantas actúa como un filtro que elimina casi todos los cambios deletéreos; los cambios genéticos que interfieren con la regeneración de las plantas-por ejemplo, un bloqueo en el metabolismo primario – no pasan por variación somaclonal a las plantas regeneradas.
La variación somaclonal puede causar una variación temporal (epigenetica) o una variación  genética. Por definición, los cambios epigeneticos no se trasmiten meioticamente, razón por la cual son útiles en el fitomejoramiento. Una variación fenotípica tiene valor en el fitomejoramiento. Una variación fenotípica tiene valor en el fitomejoramiento si proviene de una verdadera modificación del material genético, ya que una variación celular puede provenir bien de una mutación, de un cambio epigenetico o de una combinación de ambos procesos (Meins, 1983).
Causas y manifestaciones.
Un buen número de revisiones recientes sobre la variación somaclonal han tratado aspectos de este tema como su ubicuidad, sus posibles causas, y su impacto potencial en el mejoramiento vegetal (Orton, 1984; Evans et al., 1984; Larkin et al). Es necesario entender los mecanismos que dan lugar a la inestabilidad genética durante el cultivo de tejidos, por razones de orden práctico. En primer lugar, la variación somaclonal es deseable para aumentar la ocurrencia de variabilidad en el mejoramiento de plantas; es además importante donde la uniformidad de las plantas obtenidas del cultivo de tejidos sea esencial, como en la micropropagacion rápida; es importante, en tercer lugar, para controlar el mecanismo que genera esa misma variación.
El origen de la variación no siempre es claro, y puede diferir entre una planta y otra. Puede ser, por ejemplo, un reordenamiento cromosómico, considerado el principal mecanismo que genera la variación somaclonal; puede deberse a un entrecruce (crossing over) somático, a un intercambio de cromatidas hermanas, a una alteración de los nucleótidos por metilación, a una perturbación de la replicación del ADN por culpa de un deposito de nucleótidos alterados, o también al silenciamiento o activación de genes por mutaciones ocurridas en regiones no codificadas.
En varias especies cultivadas se ha detectado variación somaclonal, y se ha demostrado el control genético de las mutaciones – mediante pruebas de trasmisión genética o análisis de ADN – solo en las siguientes: en tomate (color del fruto, resistencia a las enfermedades), en tabaco (color de la hoja, manchas en la hoja), en alfalfa (color de la flor), en papa (numero de copias del ADN mitocondrial), en trigo (patrón de la izoenzima ADH), y en arroz.


3.5.1 CONSERVACION IN VITRO.
La conservación in vitro tiene que considerarse como parte dela estrategia general de conservación de una especie vegetal; es mas bien un auxiliar valioso y un suplemento de la conservación de los recursos genéticos. Solo ocasionalmente, el almacenamiento in vitro seria la única estrategia para conservar una especie dada. Para algunos frutales tropicales como el cacao (Theobroma), la estrategia principal de conservación estaría probablemente en los bancos genéticos in vitro que utilizan las técnicas in vitro para evaluar la variabilidad genética de la especie, y para la colección e intercambio de esta. Los cultivos de raíces y tubérculos, como papa, yuca y batata (Ipomoea), se almacenarían como semilla durante cortos periodos, de modo que, para ellos, los métodos in vitro serian complementarios para la conservación de genotipos específicos (cultivares, híbridos, clones elite) y para el traslado internacional de clones. Para otros cultivos de tubérculos y raíces tropicales y para especies de frutales como musa sp., que rara vez producen semilla y son practica mente estériles, el almacenamiento in vitro y los bancos genéticos ex situ en el campo estarían probablemente a la par. Por  ultimo, en las especies especies tropicales de semilla recalcitrante, la colección y el intercambio de materiales in vitro tendrán una función básica.
Estrategias para la conservación in vitro.
Es grande el rango de especies vegetales cultivadas cuya conservación es accesible a las técnicas in vitro. La conservación de los recursos fitogenéticos mediante los métodos del cultivo in vitro se logra haciendo cambios en el ambiente de cultivo para desacelerar o suprimir totalmente el crecimiento de las células y de los tejidos; el objetivo es aumentar al máximo el periodo de trasferencia del cultivo o extenderlo indefinidamente. No obstante debe realizarse, como se indico anteriormente, una evaluación científica cuidadosa de las ventajas y desventajas de una estrategia in vitro de la conservación de recursos genéticos para cada caso especifico.
Se han propuesto dos tipos de conservación in vitro de los bancos genéticos (Withers y Williams, 1985): a) el banco genético in vitro activo (IVAG, en ingles) donde los cultivos se mantienen en crecimiento lento, y b) el banco genético in vitro básico (IVBG, en ingles) donde los cultivos son crioconservados. El IVAG se esta desarrollando, en alto grado, para las especies yuca, papa, batata, banano y caña de azúcar, y constituye una colección de semilla sexual almacenada a corto plazo. El IVBG constituye una colección básica – es decir, conservada en plazos largos y no activa o de trabajo – ya que la criopreservacion no se ha desarrollado a un plenamente en ningún cultivo; este banco permite un mantenimiento total de la estabilidad genotípica del germoplasma, y su contraparte estaría representada por la colección de semillas sexual mantenida bajo almacenamiento a largo plazo.
Aspectos importantes de la conservación in vitro.
Regeneración
La regeneración de plantas enteras basada en los sistemas de cultivo de células es, a menudo, el paso que limita la aplicación de técnicas de cultivo in vitro a especies vegetales que no se pueden propagar mediante meristemas preformados. A pesar de la capacidad que tienen para iniciar callo diversos tejidos y órganos de muchas especies cultivadas, la regeneración reproducible de plantas enteras sigue siendo problemática. La regeneración adventicia mediante la embriogénesis somática es muy deseable, que el proceso ofrece altas tasa de multiplicación y produce propagulos que poseen ejes de raíz y de yema (Stamp y henshaw, 1987). Los embriones somáticos pueden desarrollarse de células únicas y se pueden recuperar plantas con genotipos mas estables (Evans et al., 1981). 
Viabilidad
La evaluación de la viabilidad de los cultivos in vitro se debe realizar sistemáticamente. En condiciones de crecimiento lento, en que el periodo de trasferencia se extiende durante meses o años, la frecuencia de evaluación de los cultivos aumenta en comparación con la evaluación que se haría al material conservado bajo nitrógeno liquido, por ejemplo, las características mas importantes que se evalúan en el almacenamiento de crecimiento lento de cultivos derivados del ápice de yemas son: contaminación, senescencia de la hoja (la razón hojas verdes /hojas muertas), numero de brotes verdes (para micropropagación adicional), numero de nudos viables (verdes) en relación con la longitud del tallo (verde), presencia o ausencia de raíces, y ocurrencia de callo.
Estabilidad genética
 La estabilidad genética de los cultivos ha sido, durante mucho tiempo, un motivo de inquietud cuando se piensa aplicar las técnicas in vitro para la conservación del germoplasma. El material recuperado de al conservación in vitro debe representar genéticamente al material utilizado. Cualquier sistema de cultivo in vitro será inaceptable si introduce un alto riesgo de inestabilidad genética o de selección entre genotipos – o de ambas cosas (Withers, 1988).
En cultivos propagados vegetativamente se han aplicado criterios morfológicos para caracterizar los genotipos, diferencias que son difíciles de detectar en los cultivos propagados in vitro. Se ha señalado que la variación genética causada por un reajuste cromosómico puede presentarse en el cultivo de tejidos (D amato, 1964). Existe también una correlación entre el tiempo en que el material vegetal se cultiva como callo y la probabilidad de que ocurran en el cambios cromosómicos; esto podría causar un cambio hacia un tipo variante en la propagación in vitro (Schilde- Rentschler y Roca, 1987).  

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